收細胞 並數數量 接著將細胞收起 並以paraformadihyde fix 接著染一抗overnight 接著再染二抗
sub cell:(10cm dish/ 7cc medium /dish)
prewarm pbs medium（10%FBS hyclone 1x DMEM) trypsin（FBS可終止作用）
將舊medium 吸起 放在空離心管（一種細胞一隻pipet 再加上medium與pbs各一隻）
以4、5cc pbs wash twice
以兩倍trypsin吸500～1000之間的量加入dish.(for 5 ~8minutes don't above 8 minutes)
用剛剛吸起來的舊medium加入dish中去中和trypsin 並沖下細胞
把細胞液全部放入剛剛放舊medium的離心管中 接著離心1000轉 3 mins for15cc 5mins for50 cc
接著有兩種處理方式
1.要sub回盤子
2.數細胞並收回準備flow
1.將剛剛的盤子以pbs wash twice
把剛剛離心後的離心管的液體吸掉 以1000接300的去吸
接著把細胞沉積物含管子在網子上刮一下
加入1cc pbs回去 並取一些回去盤子 直到裡面大約含2、3成細胞
2.加入適量pbs讓自己好數為主
數完後的濃度取自己所需的量 再補pbs到需要之總體積再分管
以這次實驗舉例 每管我們要200ul的量 而裡面每管要有3×10*5的細胞數 看看需要原本管內多少細胞 剩下吸掉
把細胞拿到隔壁（非culture room)
加入0.1%paraformadihyde fix 10~15mins
離心2000rpm 5mins
接著用pbs wash twice 一樣離5分鐘
以FACS buffer回溶每管200ul
加入每管抗體所需濃度 並染overnight（以小摩天輪）
隔天先spin down 並加入1cc pbs wash twice（以1500rpm 5mins離心）
倒掉sup
加入FACS 1cc 並離心（以1500rpm 5mins離心）
加入二抗1：500 每管只需要100ul in FACS即可
避光30分鐘
另外 若要種12well的話 一格1.5×10^5 cells in 500ul total volume
創作內容
實驗protocol cell culture&flow preparation
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